Гистологические реакции «винных пятен» после лечения лазером на парах меди

Предпосылки и цели: Объектом данного исследования является характеристика влияния эпидермального меланина на коже коричневого цвета на избирательные повреждения сосудов в «винном пятне» (PWS), вызванные излучением лазера на парах меди. 

СТРУКТУРА ИССЛЕДОВАНИЯ/МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мы наблюдали гистологические изменения «винных пятен» у корейских пациентов, которые прошли курс лечения  лазером на парах меди (длина волны 578 нм), в диапазоне плотности энергии (6-14 Дж/см²) и длительности экспозиции (30-200 мс). Для дифференциации между окрашенными в синий цвет жизнеспособными клетками и неокрашенными термически поврежденными клетками использовался метод окрашивания хлоридом нитросинего тетразолия (NBTC).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При помощи пятна Фонтана-Массона, мы обнаружили, что корейская кожа имеет больше эпидермального меланина, чем кожа белого человека. Для плотности энергии больше, чем 6 Дж/см², эпидермальных повреждений обнаружено не было. При 6 и 8 Дж/см², повреждения дермы были локализованы в кровеносных сосудах и периваскулярных тканях. Соединительная ткань между поврежденными сосудами и эпидермисом была, по-прежнему, жизнеспособна. Плотность энергии выше 10 Дж/см² произвела тепловой диффузный некроз. Мы заключаем, что при экспозиции в 50 мс при длине волны лазера в 578 нм на коричневой коже корейцев сосудистая селективность без эпидермальных повреждений не может быть достигнута. Плотность энергии для клинического минимального отбеливания составляла 6-8 Дж/см², а максимальная глубина проникновения этой плотности энергии составляла 0,4 мм. Мы также обнаружили, что повреждение эпидермиса увеличивается с увеличением ширины импульса при фиксированной плотности энергии (10 или 8 Дж/см²), а серьезность заболевания и глубина повреждения сосудов уменьшилась. Эти данные позволяют предположить, что лучше всего для лечения «винных пятен» с помощью лазера на парах меди при минимальной длительности импульса и максимальной выходной мощности допустимой при данной плотности энергии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что лечение «винных пятен» при помощи лазера на парах меди на коричневой кожи не является таким как селективным, как на белой коже, из-за эпидермального меланина.

Ключевые слова: плотность энергии, эпидермальное повреждение, длительность воздействия, корейский, меланин, длительность импульса, лазер на парах меди.

ВВЕДЕНИЕ

На селективное повреждение тканей лазерным излучением влияет длина волны, длительность воздействия (длительности импульса), а также доза облучения (плотность энергии) [1]. Оптимальная лазерная коагуляция «винного пятна» (PWS) зависит от длины волны избранного поглощения излучения оксигемоглобина (Hb0₂), целевого хромофора. Желтый свет лазера при длине волны около 577 нм соответствует одному из пиков поглощения оксигемоглобина и, таким образом, избирательно поглощается кровеносными сосудами, при условии, что излучение энергии происходит в течение достаточно  короткого периода времени, ограничивая тем самым повреждение сосудистой стенки [2].

В последнее время обнадеживающие результаты в лечении «винных пятен» были получены при использовании лазера с желтым светом при длине волны приблизительно 577 нм, то есть света, излучаемого импульсным лазером на красителе (PDL) или лазером на парах меди (ЛПМ) [3-6]. Но большинство из этих результатов были получены у пациентов белой европеоидной расы, которые имели белую кожу.

Для эффективного лечения, поглощение конкурирующего эпидермального меланина, что приводит к повреждениям эпидермиса, должно быть минимальным. Хотя эпидермальный меланин поглощает меньше желтого света, чем излучение аргонового лазера, он по-прежнему выступает в качестве конкурирующего хромофора с длиной волны около 577 нм [7,8]. Таким образом, вышележащий эпидермальный слой пигмента представляет собой потенциальный барьер, через который должны пройти 577 или 578 нм лазерного излучения, чтобы достичь основного микроциркуляторного русла. Таким образом, вполне возможно, что сложнее производить селективное повреждение сосудов в «винных пятнах» с пигментированной кожей, которую имеют корейцы, с помощью импульсов в 578 нм.

В этом исследовании мы наблюдали его моментальные гистологические изменения, вызванные излучением ЛПМ в «винных пятнах» у корейских пациентов в диапазоне от нескольких плотностей энергии и длительности экспозиции. Чтобы охарактеризовать последствия эпидермальной пигментации меланина на избирательное повреждение сосудов, мы сравнили наши результаты с результатами, полученными другими авторами, которые  использовали пациентов с белой кожей [6,9]. Метод окрашивания хлоридом нитросинего тетразолия (NBTC) использовался для дифференциации между жизнеспособными (окрашенными в синий цвет) клетками и термически поврежденными (неокрашенными) клетками [9-11].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Как сообщается, девять корейских пациентов с «винными пятнами» (4 женщины, 5 мужчин) получали лечение при помощи лазера на парах меди (ЛПМ). Возраст пациентов варьировался от 17 до 45 лет (средний возраст 27 лет). Определяющий цвет кожи корейцев можно разделить на фототип кожи III, IV, или V [12]. Все «винные пятна» были расположены на лице, в том числе на передней части головы. Шесть поражений имели фиолетовый цвет, а остальные были красновато-фиолетового или красного цвета. Ни один из пациентов ранее не лечился.

Лечение при помощи лазера на парах меди

Использовался ЛПМ (VCM-10, Visiray Co., Австралия). Он производит две длины волны, которые могут излучаться как по отдельности, так и вместе: зеленого цвета (511 нм) и желтого цвета (578 нм). Длина волны желтого цвета регулируется до максимум 2,5 Вт. Данный ЛПМ производит импульсы с длительностью импульсов в 24 нс. Приблизительно излучается 12 000 импульсов/с (12 кГц). В данном исследовании мы использовали длину волны желтого цвета (578 нм) в двух типах экспериментальных условий. В первом из них мы меняли плотность энергии от 6 до 14 Дж/см² и сохраняли длительности воздействия на постоянном на уровне 50 мс. Во втором, мы меняли длительность экспозиции от 30 до 200 мс и сохраняли плотности энергии фиксированными либо 8, 10, или 12 Дж/см². После сбривания всех волос, кожа вокруг волос подвергалась воздействию несколько доз лазерного света. Все процедуры проводились без анестезии.

Лазерный свет производился устройством Hexascan (компания Prein & Partners, Франция), автоматизированной системой подачи, с помощью точки с диаметром 1 мм [13]. Эта система состоит сканирующего наконечника с микропроцессорным управлением, который подключен через модуль управления к волоконно-оптической системе доставки лазерного излучения. Автоматизированная программа помещает импульсы лазерной энергии, разделенные промежутками в 50 мс, в точные, несмежные шаблоны сканирования, чтобы рассеять нежелательную тепловую энергию между экспозициями. Желаемое количество влияющей энергии, было выбрано на панели управления устройства Hexascan.

Гистохимические процедуры

У каждого пациента при заранее обусловленной дозе экспозиции были взяты три или четыре 3-мм образца пункционной биопсии под местной анестезией с использованием 2% раствора лидокаина. Все образцы биопсии были получены в течение 15 минут после лазерного лечения и были разделены на обычные методы: H & E (метод окрашивания гематоксилином и эозином), метод окрашивания Фонтана-Массона, и метод окрашивания NBTC. Ткани для окрашивания методом использования NBTC были заморожены в жидком азоте и хранились при температуре -70°C. Выбор всех тканей происходил на нескольких уровнях с помощью микротома криогенной резки (Reiter-Jung Cryocut 1800, Reiter-Jung, Германия). Образцы для окрашивания методом использования NBTC были обработаны, как было описано ранее.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При окрашивании NBTC, все жизнеспособные клетки эпидермиса и дермы представляли синее пятно с мелкими цитоплазматическими, пигментными гранулами, «удерживающими» ядра. Роговой слой и кожный коллаген остались неокрашенными. Нормальные структуры эпидермиса и кровеносные сосуды были хорошо выраженные (рис. 1). В окрашенных NBTC срезах можно было четко наблюдать наличие пигмента меланина в базальном слое ячейки. Секции, окрашенные методом Фонтана-Массона, показали, что корейская кожа содержит больше пигмента меланина в эпидермисе, чем белая кожа (рис. 2). В секциях, окрашенных методом Фонтана-Массона, в эпидермисе пациента 4 было меньше пигмента меланина, чем у трех других пациентов (данные не приведены).

Мы наблюдали гистологические изменения, происходящие в результате увеличения плотности энергии 6, 8, 10, 12 и 14 Дж/см² с фиксированной длительностью воздействия в 50 мс (табл. 1). Для плотности энергии 6 Дж/см2 и выше в пятне H & E, клетки эпидермиса показали морфологические изменения базального слоя клетки (удлинение клеток, вертикальное удлинение ядер и вакуолей в цитоплазме) (рис. 3). При 8 Дж/см², наблюдались диффузные морфологические изменения эпидермиса в целом, с удлинением и образованием пузырьков ядер, и базофильной дегенерацией верхней дермы (рис. 4). Разделение дермо-эпидермального соединения наблюдалось также при плотностях энергии в 6 и 8 Дж/см² (рис. 4). Тяжесть этих морфологических изменений и длина поврежденного эпидермиса увеличилась при 10 и 12 Дж/см².

При окрашивании NBTC, все клетки эпидермиса оказались жизнеспособными при 6 Дж/см². При 8 Дж/см², некоторые эпидермальные клетки показали более слабое пятно NBTC. При плотности энергии выше 10 Дж/см², было заметное ослабление пятна NBTC и диффузного коагуляционного некроза эпидермиса , за исключением пациента 4. У этого пациента некоторые клетки эпидермиса показали слабое пятно NBTC при плотности энергии до 14 Дж/см².

В основной дерме при 8 Дж/см² термическое повреждение было ограниченным кровеносными сосудами папиллярной и среднеректикулярной дермы. Кроме того, был поврежден манжет периваскулярного коллагена. Соединительная ткань между эпидермисом и вышележащими периваскулярными некротическими тканями остается жизнеспособной. Некоторые поверхностные кожные сосуды и эпидермиса находились так близко, что соединительная ткань между эпидермисом и сосудами показала диффузный некроз. Плотность энергии 6 Дж/см² также вызвала тепловое повреждение, изолированное поверхностными кожными сосудами у пациента 2, но не у пациентов 1 и 3. При 10 Дж/см² наблюдался диффузный некроз коагуляции соединительной ткани между целевыми сосудами и эпидермисом.

Плотность энергии для минимального клинического отбеливания составляет 6-8 Дж/см² у всех четырех пациентов. При таких параметрах плотности энергии морфологические изменения клеток эпидермиса уже были произведены. Глубина повреждения сосудов измерялась с помощью световой микроскопии от  дермо-эпидермального соединения до внутренней вертикальной границы между неокрашенной и окрашенной в синий цвет тканями. При плотности энергии в 8 Дж/см² диапазон глубины тепловой травмы составлял 0,25-0,4 мм. Увеличение глубины травмы коррелирует с увеличением плотности энергии.

Также мы наблюдали гистологические изменения, вызванные увеличением длительности импульса при фиксированной плотности энергии в 12,10 и 8 Дж/см². При плотности энергии в 12 Дж/см² не было никаких существенных различий в степени тяжести эпидермальных и дермальных повреждений между длительностью воздействия в 50, 100, 150 и 200 мс. Но при 10 и 8 Дж/см² наблюдается увеличение повреждения эпидермиса и снижение повреждения кожных кровеносных сосудов с увеличением длительности импульса (30 - 140 мс у пациента 6 и 50-150 мс у пациента 7). Также с увеличением длительности импульса уменьшается глубина повреждения сосудов.

Наконец, мы наблюдали гистологические изменения «винных пятен» через 1-2 месяца после лечения ЛПМ у двух пациентов, которые проходили лечение с плотностью энергии в 14 Дж/см² и длительностью импульса в 56 мс. Эпидермис выглядел нормальным, а количество и размер сосудистых структур в верхней и средней дерме заметно сократились и заменились коллагеном.

ОБСУЖДЕНИЕ

Гистохимические окрашивание при помощи NBTC для определения жизнеспособности клеток в термически поврежденной коже было установлено ранее [10,11]. Снижение NBTC с помощью диафоразы никотинамид-аденин-динуклеотида (NADH-диафоразы) производит интенсивный синий пигмент в цитоплазматических замороженных участках тканей. Как было показано, активность этого фермента идет на убыль сразу же после гибели клеток. Из-за заметной разницы цвета между жизнеспособнымим и нежизнеспособными структурами, метод NBTC обеспечивает точное и быстрое представление о масштабах повреждения, вызванного избыточным воздействием тепла. Он позволяет идентифицировать лазерную травму путем прямой демонстрации некроза стенки сосуда и степени повреждения периваскулярной соединительной ткани [9].

В нашем исследовании морфологические изменения в базальных клетках появились начиная с 6 Дж/см², а потеря жизнеспособности клеток эпидермиса появилась, начиная с 8 Дж/см². Но в дерме, при параметрах плотности энергии в 6 и 8 Дж/см² повреждения были ограничены кровеносными сосудами и окружающим коллагеном. Стромальные ткани между поврежденными сосудами и эпидермисом были по-прежнему жизнеспособны. Плотность энергии в 10 Дж/см² и выше произвели клиновидный диффузный коагуляционный некроз. Таким образом, становится очевидным, что сосудистая селективность без эпидермальных повреждений при длине волны лазера в 578 нм на коричневой коже корейцев не может быть достигнута.

Нейманн и соавт. изучили гистохимические изменения, происходящие через 15 минут после лечения с использованием ЛПМ пациентов с белой кожей, имеющих «винные пятна», используя метод NBTC [9]. Они использовали диапазон плотностей энергии 8-32 Дж/см² при длине волны 578 нм с максимальной выходной мощностью 1,3 Вт. В их исследовании, воздействие на кожу с «винными пятнами» составляло до 8-12 Дж/см² (соответствующая длительность импульса находилась в диапазоне 50-74 мс) не изменило целостность клеток эпидермиса, но могло вызвать повреждение, которое ограничивается кровеносными сосудами и окружающим коллагеном, в то время как более высокие дозы (> 15 Дж/см²) вызывали неспецифические повреждения тканей.

Корейская кожа выглядит коричневато и, более пигментирована, чем белая кожа. Фототип кожи корейцев, как правило, подразделяются на типы III, IV и V. Наши результаты показывают, что повреждения эпидермиса на коричневой коже, вызванные излучением ЛПМ происходит при более низких плотностях энергии, чем на белой коже, а диапазон плотностей энергии, который показывает селективность в дерме, значительно уже, чем для белой кожи [6,9].

Такая различная гистологическая реакция на ЛПМ для белой и корейской кожи возникает из-за разной степени меланизации кожи. Целью на коже для излучения ЛПМ является оксигемоглобин внутрисосудистых эритроцитов, и приводит к селективному разрушению кровеносных сосудов с сохранением вышележащего эпидермиса. Однако эпидермальный меланин действует как конкурирующий хромофор, а целевая специфика желтого света лазера находится под влиянием изменений в эпидермальной пигментации [7]. Белая кожа имеет меньше общего количества меланина, чем кожа монголоидной расы [14]. Мы также обнаружили, что в пятне Фонтана-Массона пигмента меланина присутствует в большем количестве в низком остистом слое эпидермиса корейской кожи по сравнению с белой кожей. Пигмент меланина поглощает лазерное излучение и генерирует тепло, которое проводится на соседний эпидермис и основную дерму, результатом чего является неспецифической коагуляционный некроз эпидермиса и верхней дермы. В нашем исследовании мы наблюдали диффузный некроз эпидермиса, который начинался при 10 или 12 Дж/см² у пациентов 1, 2 и 3.

Но у пациента 4, из-за меньшей пигментации меланина, диффузный некроз эпидермиса не появился до 14 Дж/см². Эти результаты позволяют предположить, что лазеры, излучающие желтый свет, например, ЛПМ и импульсные лазеры на красителях, не могут дать тот же результат лечения «винных пятен» на пигментированной коже, как и на белой коже.

В нашем исследовании при 8 Дж/см² с использованием ЛПМ, соединительные ткани стромы между сосудами и вышележащим эпидермисом были жизнеспособными. Это означает, что ЛПМ отличаются от лазеров на аргоне, так как лазеры на аргоне производят диффузный некроз, который распространяется от эпидермиса [11]. Хотя ЛПМ вызывал повреждение эпидермиса у всех пациентов в этом исследовании, в отличие от лазера на аргоне [2,15], гистологические результаты через 1-2 месяцев у пациентов 8 и 9 показали, что эти повреждения не были постоянными.

Кроме длины волны, длительность воздействия лазера также влияет на степень, при которой тепло во время воздействия будет ограничиваться целевым сосудом. Известно, что если длительность воздействия велика, по сравнению со временем, необходимым для диффузии тепла в окружающих структурах, тепловое повреждение будет обширным и неспецифическим, несмотря на то, как конкретно поглощается лазерный свет и как он нагревает целевую структуру [1].

Нейманн и соавт. сообщили, что при длительности воздействия ЛПМ в 50-74 мс на белой коже наблюдается избирательное повреждение сосудов. Но в их исследовании увеличение длительности импульса вызывало увеличение плотности энергии. В нашем исследовании мы компенсировали этот рост за счет уменьшения выходной мощности, таким образом, чтобы плотность энергии сохранялась постоянной. Наши результаты показывают, что с увеличением длительности воздействия, повреждение клеток эпидермиса увеличивается постепенно. С другой стороны, степень тяжести повреждения сосудов и глубина повреждения коллагена уменьшается с увеличением длительности воздействия. В нашем исследовании эти сниженные тепловые эффекты в дерме могли произойти в результате снижения мощности на выходе с увеличением длительности воздействия. При более длительном импульсе и более низкой мощности лазера тепло распространяется вокруг, и поэтому будут достигнуты более низкие температуры, что может объяснить меньшие глубины повреждений. Это говорит о том, что для достижения лучших результатов лечения с использованием ЛПМ, необходимо проводить лечение с максимально возможной выходной мощностью и минимально возможной длительностью импульса при данной плотности энергии.

В недавних исследованиях ЛПМ, порог потока для клинического отбеливания белой кожи, как оказались, находится в диапазоне 17-25 Дж/см² [6] или 15-20 Дж/см² [9]. По сравнению с порогом потоков отбеливания в 6-8 Дж/см² в нашем исследовании, пороги для белой кожи очень высоки. Уже известно, что срочное клиническое отбеливание всегда свидетельствует о некрозе эпидермальной коагуляции из-за поглощения меланином эпидермиса [4,9]. Эпидермальный меланин, в изобилии имеющийся в коричневой коже, может играть важную роль в снижении порога отбеливания в нашем исследовании.

В нашем исследовании глубина проникновения оказалась зависящей от плотности энергии и мощности в фиксированной длительности импульса (50 мс). При плотности энергии в 8 Дж/см² можно достигнуть глубины проникновения в дерме до 0,4 мм. Несмотря на пигмент меланина в коричневой коже, эти результаты не показали существенного отличия от глубины в белой коже [9]. Увеличенная выходная мощность ЛПМ, который используется в нашем исследовании, привела к увеличению проникновения достаточного количества света лазера, чтобы вызвать некроз.

Таким образом, мы продемонстрировали, что лечение «винных пятен» при помощи ЛПМ на коричневой кожи не является, таким же селективным, как и на белой коже, из-за эпидермального меланина .